S metodou PCR se nehandluje!

NÁZORY ČTENÁŘŮ

S metodou PCR se nehandluje! 1
Názory čtenářů

Jiří Vácha

V poslední době vyšly v Echu články, ve kterých jsou zmínky o jedné z metod na přítomnost koronaviru 2019-nCo, způsobujícího nemoc covid-19. Je řeč o metodě PCR, „polymerázové řetězové reakci“. Zdá se, že metoda PCR se u nás stala důležitým politikem a v oněch článcích se referuje o tom, že PCR vystupuje jako zdroj nejistoty a společenského napětí. Metodě PCR je potřeba do jisté minimální míry rozumět, aby se ukázalo, k čemu a jak je možné ji používat. Jestli se jí zaštiťuje tlak na „otevírání“, nebo „zavírání“, je to, jako by se nůž činil odpovědným za vraždu.

PCR je rutinní laboratorní technika, které se dá použít k určení přítomnosti nějakého genetického materiálu, popř. ho namnožit pro jiné účely. Metoda je schopná multiplikovat malý, dobře definovaný a nikde jinde v přírodě se nevyskytující úsek RNA, až mnohomilionkrát. (Genom koronaviru je složen z RNA a metoda si musí genetickou informaci napřed přeložit z RNA do DNA, ale to je jen technický detail.) PCR tak jednoznačně detekuje typickou část genomu koronaviru, a to i když tato část je přítomná v extrémně malých množstvích. Podstatou PCR je vytváření kopií zkoumaného úseku genomu, kopií těchto kopií atd., což znamená, že počet kopií roste exponenciálně (v ideálním případě s n-tou mocninou dvou, tedy na 2, 4, 8, 16 atd. násobek až po milionové počty původního množství molekul). PCR se běžně užívá k bližšímu zkoumání různých genomů, poněvadž pro jejich čtení je potřeba mít velká množství materiálu, přičemž se někdy vychází i z nepatrných stop – vzpomeňme jen na luštění genomu mamutů nebo prehistorického člověka z jediného zachovaného prstu. PCR je o dva až tři řády citlivější než většina rychlých testů založených ne na genomech virů, ale na jejich povrchových strukturách. Zároveň je potřeba jasně říci, že PCR není primárně metoda na určení kvanta genetického materiálu ve vzorku a že to platí jak o původní jednoduché metodě PCR, tak o její vylepšené verzi zvané kvantitativní PCR (qPCR čili „metoda PCR v reálném čase“). V případě epidemie koronaviru jde především o to, aby se dali z populace vytřídit nakažení, aby se dala posoudit závažnost jejich nakažení virem a prognóza jejich zdravotního stavu. K těmto úkolům se PCR dá použít jen s velkou obezřetností a vždycky v souvislosti s jinými ukazateli, jak ještě uvidíme.

Ukazatelem správnosti testu jsou tzv. senzitivita (citlivost) testu a specificita testu: senzitivita testu je jeho schopnost rozpoznat skutečně nemocné osoby, tedy pravděpodobnost, že test bude pozitivní, když je osoba skutečně nemocná; specificita testu je jeho schopnost rozpoznat osoby bez nemoci, tedy pravděpodobnost, že test bude negativní, když osoba není nemocná (že nebude vytvářet falešně pozitivní výsledky). U metody PCR je velmi důležité rozlišovat její vlastní citlivost (tzv. „instrumentální senzitivitu“) od její citlivosti v širším kontextu, od jejího „klinického výkonu“. Vlastní citlivost PCR je obrovská a její specificita rovněž. Vysoká citlivost samozřejmě znamená, že je to metoda velmi háklivá na znečištění, např. prsty laborantů, předchozími vzorky v přístrojích atd. Důležité jsou i „předlaboratorní“ fáze: způsob odebírání vzorků od osob, uskladnění a způsobu transportu vzorku. To všechno jsou ovšem samozřejmosti, kterých je si zdravotnický personál dobře vědom a snaží se jich ze všech sil vyvarovat. Nevyhnutelná chyba zpracování není známa, odhaduje se někde mezi 0,8 % a 4,0 %. Vysoké instrumentální specificitě PCR je potřeba dobře rozumět: ta skutečně nepodává faklešně pozitivní výsledky, ale jen vzhledem k tomu, k čemu je určena, tj. k nalézání vytipovaných částí genomu koronaviru.

Ještě komplikovanější je otázka klinického výkonu testu PCR, tj. její schopnosti přinášet výsledky zavčas, technicky a dopravně dostupně a také levně. Zde je kontext zcela zásadní. Klíčová otázka nezní, jak citlivě mohou být molekuly detekovány v jednotlivém vzorku, ale jak účinně může být infekce detekována v populaci opakovaným používáním testu jako součásti celkové testovací strategie, tj. otázka senzitivity testovacího režimu. Režim pravidelného testování pracuje jako jakýsi filtr na covid-19, a to tak, že idendifikuje, izoluje a tak „odfiltrovává“ nakažené osoby, včetně těch, které nemají žádné příznaky. Senzitivita testovacího režimu závisí na tom, jak často je test používán, komu se aplikuje, kdy se aplikuje v průběhu nemoci a jestli jsou výsledky k dispozici dostatečně rychle, aby se zabránilo šíření infekce. Zatímco analytický výkon mnoha PCR testů na koronavirus se blíží 100 %, závisí klinický výkon na biologii a preanalytických faktorech a blíží se 80 % sensitivity a 98–99% specificity.

Tak jak je metoda PCR po mnoha stránkách referenční pro všechny testy na koronavirus, není vhodná jako metoda populačního filtrování: testování pomocí PCR vyžaduje kvalifikovaý personál, metoda je drahá a zatím zdlouhavá: než dojdou výsledky PCR, může infikovaná asymptomatická osoba šířit infekci. Odtud vyplývá požadavek zajistit dostatek levných, jednoduchých a rychlých testů, pracujících na jiných principech (typicky na rozpoznávání povrchových struktur viru) a dostatečně senzitivních a specifických. Poněvadž se virus může vyskytovat na různých místech těla, je podle toho potřeba volit i místa odběru materiálu, ale to už je jiná otázka.

Není možné chtít po laboratořích, aby udávaly v souvislosti s PCR hranice „normálního“ („referenčního“) intervalu, jak to dělají u všech běžných biochemických a hematologických vyšetření. Nemoc covid-19 probíhá dramaticky – v řádu dní, ne-li hodin, a bez znalosti anamnézy vyšetřované osoby a klinického průběhu není vůbec možné laboratorní hodnoty interpretovat. Inkubační doba covidu je v průměru 5 dní, ale už 2–3 dny předtím může infikovaná osoba přenášet virus na ostatní. Po objevení se prvních příznaků nemoci množství viru prudce stoupá a po dosažení vrcholu se pokles protahuje a pozitivní hodnoty PCR mohou přetrvávat po celé týdny. Metoda PCR však nedokáže rozlišit, jestli jsou přítomny infekční viry, nebo jen části jejich genomu, které už infekční nejsou. Z tohoto hlediska je důležitý právě onen „ohon“ pozitivních nálezů PCR. Zde je potřeba se obrátit k jiným metodám. Virus můžeme pěstovat v kulturách buněk a sledovat, jestli je schopen se v nich množit, nebo ne. Jestli není schopen množit se v kultuře, je to spolehlivý indikátor, že se už nemnoží ani v člověku a že tento pacient už nenakazí své okolí. Z výsledků kultivačních studií plyne, že virus není pravděpodobně schopen infikovat druhé osoby už po 10–14 dnech po prvních symptomech nemoci. Dlouhé trvání RNA pozitivního ohonu naznačuje, že většina infikovaných lidí je identifikována až poté, co jejich infekční období skončilo. Pozitivitě testů PCR v pozdních fázích nemoci se bude muset věnovat zvýšená výzkumná pozornost, poněvadž považovat osoby mylně za nakažlivé má samozřejmě vážné důsledky pro ně samé a stejně tak i pro populaci a pro státní politiku. Je naopak potřeba studovat i to, že je nezanedbatelné množství lidí, kteří nikdy neprojevili známky nemoci, přesto jsou infekční. U asymptomatických osob není často známo, kdy se infikovaly a ve kterém stadiu nemoci právě jsou, a jaké je tedy riziko, že jsou infekční. Osvětová kampaň musí veřejnosti sdělit, že jakýkoli negativní test nutně nezaručuje stav zdraví, a důrazně doporučovat prostorovou distanci a nošení roušek.

Diskuse vzbudila veličina, která často vyvolává v souvislosti s PCR zdání jakéhosi kvantitativního ukazatele virové nálože, totiž počet množicích cyklů, nezbytných k tomu, aby se „aktivita“ vzorku zvedla nad hodnoty šumu. Je to číslený údaj, po kolika množicích cyklech se ve vzorku objeví zřetelný „signál“. Tato hodnota bývá označována jako Ct nebo Cq čili kvantifikační cyklus. Ačkoli vzorky s nízkými hodnotami Ct mají všeobecně řečeno víc virové RNA než vzorky s vyššími hodnotami Ct, nikdo zatím neurčil, jaký je přesný kvantitativní význam tohoto parametru. Nejspíš půjde jen o ukazatel semikvantitativní, od kterého není možné si víc slibovat, než jen že zkoumaný vzorek obsahuje viru „málo“, „středně“ nebo „mnoho“. Hodnoty Ct se mohou značně lišit mezi metodami, i když jsou založeny na množení téhož genu. Podobné hodnoty Ct byly pozorovány u osob s příznaky a bez příznaků. Někteří autoři doporučují, aby laboratoře hodnoty Ct lékařům vůbec nesdělovaly a omezily se na pouhé „ano“ a „ne“. Když víme na základě jiných metod, kdy přestává být pacient infekční, nemá cenu se přít, jestli k rozsudku „zdráv“ či „nemocen“ je potřeba 25, 30 nebo 35 cyklů. U vyšších cyklů ostatně ztrácí metoda efektivitu. Není to tedy tak, že by hodnota Ct mohla být předmětem nějakého politického handlu, leda velmi pokleslého.

Ještě malou aktuální poznámku k dějinám metody PCR. PCR vymyslel Američan Kary Mullis v roce 1983 a o deset let později za svůj objev získal Nobelovu cenu. Všeobecné schéma PCR se od roku 1985 nezměnilo. Vynález PCR mohutně podpořil výzkum v mnoha oblastech biologie a velmi významně přispěl k dnešní úrovni poznání v mnoha oblastech výzkumu. V současnosti však vznikly nejasnosti ohledně úlohy čínských vědců ve vývoji metody PCR. Střízlivá skutečnost je taková: Čínské úřady oznámily případy zápalu plic neznámého původu ve městě Wu-chan 31. prosince 2019. Jako původce byl 7. ledna oficiálně oznámen koronavirus, označený jako 2019-nCo. Jeho Číňany přečtený genom byl zveřejněn 10. ledna. Aby už předem připravil diagnostický nástroj pro nový virus, než opustí hranice Číny, využil Němec Christian Drosten svých znalostí příbuzného koronaviru k vypracování detekce nového viru pomocí metody PCR. Obecná metoda PCR musí být vždycky adjustována na materiál, na který se má použít. Aniž by měl ještě k dispozici virus sám, Drosten detekci viru 219-nCo kompetentně navrhl a prokázal na půldruhém tuctu jiných patogenních virů její vysokou specificitu. Svou metodu publikoval se svými spolupracovníky v odborném tisku 23. ledna 2020. Metoda přesvědčila a byla převzata a rozšířena do světa Světovou zdravotnickou organizací (WHO). Je nemyslitelné, aby čínští odborníci publikovali nepravdivé údaje o detailní struktuře (pořadí „písmen“) 2019-nCoV, poněvadž v nejbližších týdnech se mohl o složení viru přesvědčit kdokoli v oblastech, kam se virus začal bleskově šířit. Drostenova metoda je čínská asi tak, jako je čínský americký automobil, do kterého jste nalili čínský benzin. Přinejmenším po této stránce jsme se loni Číňany rozhodně nestali.

Jiří Vácha, autor je lékař a vědec